DETEKSI VIABILITAS BENIH MENTIMUN MELALUI UJI
TETRAZOLIUM DAN PENGUKURAN LAJU RESPIRASI
Latar Belakang
Benih
disebut viabel atau nonviabel bergantung pada kemampuannya berkecambah dan
menghasilkan kecambah normal. Menurut seed
physiologist, perkecambahan didefinisikan sebagai munculnya radikula
melalui kulit benih (testa). Bagi seed
analyst, perkecambahan adalah muncul dan berkembangnya struktur esensial
embrio yang menunjukkan kemampuan menghasilkan tanaman normal pada kondisi favorable (optimum) (Ilyas 2012).
Pengujian
daya berkecambah merupakan salah satu metode pengujian viabilitas benih dengan
indikasi langsung, artinya pada akhir pengujian penguji / analis mendapatkan
hasil pengujian berupa kecambah-kecambah yang harus dinilai/diamati. Tujuan
dari pengujian daya berkecambah adalah untuk menentukan potensi perkecambahan
maksimum dari suatu lot benih yang dapat digunakan untuk membandingkan mutu
benih dari lot yang berbeda dan untuk menduga mutu benih sebagai bahan tanam
(Ilyas dan Widajati 2015).
Pengujian vigor
bertujuan untuk mendapatkan informasi tentang nilai daya tumbuh (planting value) dalam kondisi lingkungan
kisaran luas dan/atau potensi penyimpanan dari lot benih. Pengujian ini
memberikan informasi tambahan dalam pengujian daya berkecambah untuk membantu
dalam pembedaan antar lot benih dengan daya berkecambah yang sudah memenuhi
persyaratan (Acceptable germination).
Lot benih yang dikategorikan bervigor tinggi adalah benih yang mampu untuk
berkembang dengan baik walaupun dibawah kondisi lingkungan yang tidak optimal
untuk pertumbuhan spesies benih tersebut.
Pengujian vigor benih
dapat dilakukan secara langsung atau tidak langsung. Metode langsung dilakukan
dengan menguji benih pada lingkungan yang tidak sesuai (environtment stresses) atau kondisi lain yang dapat diciptakan di
laboratorium dan dilakukan pencatatan persentase dan/atau kecepatan munculnya
kecambah. Pengujian vigor benih secara langsung diantaranya corn cold test,
hoppe test, brick grit test, osmotic test, AAT atau RAM.
Pengukuran tidak
langsung dapat dilakukan dengan 1) pendekatan fisiologi : Indeks vigor,
kecepatan perkecambahan, keserempakan tumbuh, pengukuran bobot kecambah,
pengukuran pertumbuhan linier struktur embrio 2) pendekatan fisik : warna benih,
bobot benih (gravitasi spesifik), daya hantar listrik (DHL), X-Ray test 3)
pendekatan biokimiawi : Uji TTZ, kandungan ATP, aktivitas respirasi, kebocoran
membran sel (gula, asam amino, asam lemak).
Uji
tetrazolium merupakan uji biokimiawi yang biasa digunakan untuk menduga
viabilitas benih secara cepat: jika benih yang baru dipanen akan segera
ditanam, benih yang memiliki dormansi lama, benih yang perkecambahannya lambat
pada saat ditanam, atau jika dibutuhkan data viabilitas potensial dengan
segera. Benih viabel adalah benih yang menunjukkan pewarnaan pada jaringan
–jaringan yang nantinya akan berkembang menjadi kecambah normal. Benih yang
viabel harus ditunjukkan oleh aktivitas biokimiawi benih untuk menghasilkan
kecambah normal. Uji tetrazolium menggunakan zat indikator 2,3,5-triphenyl
tetrazolium klorida untuk mengindikasikan adanya sel-sel yang hidup. Bila
imdikator diimbibisi oleh benih ke dalam sel-sel benih yang hidup akan terjadi
proses reduksi dengan menerima hidrogen dari enzim dehidrognase sehingga
terbentuk zat trifenil formazan yang stabil dan berwarna merah. Proses ini akan
membedakan jaringan hidup yang membentuk warna merah dan jaringan mati yang
tidak berwarna (ISTA 2014).
Aktivitas
metabolisme yang dapat digunakan dalam deteksi viabilitas benih misalnya laju
respirasi. Beberapa faktor yang mempengaruhi hasil pengukuran laju respirasi
adalah suhu, volume dan konsentrasi, luas permukaan, lama inkubasi, viabilitas
benih dan kontaminasi mikroorganisme.
Karakteristik uji vigor benih hasil pengujiannya dapat diulang, mewakili
dan berhubungan dengan pertumbuhan di lapang di bawah kondisi tertentu, cepat,
objektif, cukup mudah untuk dilakukan oleh orang yang kurang terlatih dan
praktis secara ekonomi (murah) (Copeland dan Mcdonald 2001).
Tujuan
Praktikum
ini bertujuan untuk menguji viabilitas benih mentimun melalui uji tetrazolium
dan pengukuran laju respirasi benih mentimun dengan metode titrasi.
Metode
Tempat
dan Waktu
Praktikum
ini dilaksanakan pada tanggal 22 Maret- 3 Mei 2016. Pengujian viabilitas benih
mentimun dilaksanakan di Laboratorium Penyimpanan dan Pengujian Mutu Benih; pengujian
tetrazolium benih mentimun dilaksanakan di Laboratorium Molekuler Tanaman; pengujian
respirasi benih mentimun dilaksanakan di Laboratorium Biologi dan Biofisik
Benih, Departemen Agronomi dan Hortikultura, Fakultas Pertanian, Institut
Pertanian Bogor.
Bahan
dan Alat
Bahan dan alat
yang digunakan dalam pengujian daya berkecambah benih mentimun adalah 3 lot
benih mentimun, kertas buram, label, alat pengepres kertas, dan boks mika.
Bahan dan alat yang digunakan pada uji tetrazolim benih mentimun adalah 3 lot
benih mentimun, larutan garam tetrazolium 0.7%, aquades,glass
jar, pinset, mikroskop stereo, dan kamera. Bahan dan alat yang digunakan pada
uji respirasi benih mentimun adalah 3 lot benih mentimun, KOH 0.2 M, HCl 0.4 M,
indikator phenolftalein, indikator metal orange, aquades, pipet, erlenmeyer,
stoples, glass jar, selotip, dan kertas buram.
Tabel 1 Identitas lot benih yang digunakan
dalam praktikum
Lot
|
Varietas
|
Tanggal kadaluarsa
|
A
|
Penus
|
Februari 2014
|
B
|
Vanesa
|
Juli 2016
|
C
|
Vanesa
|
April 2017
|
Rancangan
Percobaan dan Analisis Data
Percobaan
dilakukan dengan menggunakan rancangan acak lengkap, dimana lot benih mentimun (lot
A, lot B, dan lot C) sebagai faktor perlakuan. Masing-masing perlakuan dibuat
dalam 4 ulangan. Masing-masing lot diuji mutunya menggunakan 3 metode uji mutu yaitu
uji daya berkecambah, uji tetrazolium, dan uji respirasi benih.
Model linear yang
digunakan dalam percobaan adalah:
Yij=µ+Ti+εij
Dimana : i=1,2,3 dan j=1,2,3,4
Yij = nilai pengamatan pengaruh perlakuan lot
benih ke-i, dan ulangan ke-j
µ =nilai tengah umum hasil percobaan
Ti =pengaruh lot mentimun ke-i
εij = pengaruh acak percobaan lot benih ke-i,
ulangan ke-j
Data yang
diperoleh dianalisis menggunakan uji F, apabila hasil menunjukkan pengaruh
nyata, maka dilakukan uji lanjut menggunakan uji Beda Nyata Terkecil (BNt)
dengan taraf α=5%.
Metode
Percobaan
a. Uji daya berkecambah benih mentimun dengan
metode kertas dilipat / pleated paper
Kertas buram yang telah dilembabkan
sebanyak 3 lembar dilipat menjadi 4 seperti kipas. Benih diletakkan diantara
lipatan kertas tersebut secara merata dengan jarak tanam teratur. Jumlah benih
yang digunakan tiap satu pleated paper
sebanyak 25 butir. Kelembaban kertas dijaga dengan menyemprotkan air secara
berkala dan kertas diletakkan dalam boks mika yang ditutup rapat. Pengamatan
daya berkecambah benih mentimun dilakukan pada 3 HST (hitungan I) dan 5 HST
(hitungan II) (modifikasi dari ISTA 2014).
Daya berkecambah merupakan persentase
benih yang tumbuh menjadi kecambah normal dibagi dengan jumlah benih yang dikecambahkan.
Perhitungan daya berkecambah dihitung dengan rumus sebagai berikut:
|
|
|
% DB =  |
Keterangan:
DB : daya berkecambah (%)
KN I : kecambah normal pada hitungan pertama
KN II : kecambah normal pada hitungan kedua
b. Uji vigor benih mentimun melalui uji
tetrazolium
Uji
tetrazolium diawali dengan melembabkan setiap lot benih masing-masing 75 butir
yang diulang sebanyak 4 ulangan. Benih mentium direndam dalam air
selama 18 jam pada ruangan dengan suhu 20°C. Pengupasan
testa benih dilakukan agar larutan tetrazolium mudah meresap ke dalam jaringan
benih. Larutan tetrazolium 0.7% diperoleh dengan
cara melarutkan 0.7 gram garam tetrazolium (2,3,5 triphenil tetrazolium chlorida)
dilarutkan kedalam 100 ml aquades. Selanjutnya benih direndam dalam larutan
tetrazolium klorida 0.7% sampai benih terendam seluruhnya pada
suhu 40°C selama 4 jam. Setelah inkubasi selesai, larutan tetrazolium dituang dengan
menggunakan saringan teh, benih dicuci dengan air mengalir sampai bersih (bebas
dari larutan tetrazolium). Benih satu per satu diamati menggunakan mikroskop
stereo dan diklasifikasikan sesuai dengan pola pewarnaan. Persentase benih
viabel dan non viabel dihitung.
c. Uji vigor benih mentimun melalui uji
respirasi benih
Uji respirasi benih mentimun dilakukan
dengan langkah-langkah sebagai berikut:
-
Sebanyak 3 lot benih metimun @25 butir
ditanam dalam stoples yang sudah dialasi dengan 3 lembar kertas buram lembab.
-
Glass
jar
yang berisi 30 ml larurtan KOH 0.2 N dimasukkan di posisi tengah stoples,
kemudian stoples ditutup rapat dan direkatkan menggunakan lakban.
-
Untuk blanko, dengan metode yang sama
dengan diatas tapi tidak ditanami benih.
-
Inkubasi dilakukan selama 7 hari, kemudian
stoples dibuka dan larutan KOH dituang ke dalam erlenmeyar 50 ml.
-
Larutan KOH di dalam erlenmeyer
ditambahkan 1 tetes indikator phenolftalein dan dititrasi dengan HCl 0.4 M
sampai warna merah jambu hilang.
-
Selanjutnya pada erlenmeyer ditambahkan 1
tetes indikator metil orange dan dititrasi dengan HCl 0.4 M sampai terbentuk
warna merah orange.
Reaksi
pengikatan CO2 oleh KOH
2 KOH + CO2 K2CO3 +
H2O
Titrasi
tahap I
KOH + HCl KCl + H2O
Titrasi
tahap II
K2CO3 +2 HCl 2 KCl + H2O + CO2
-
Perhitungan aktivitas respirasi dengan
menghitung CO2 yang diproduksi dengan rumus :
mg CO2
= (a-b) x N x 44
t
a : ml HCl hasil titrasi tahap kedua pada
stoples berisi benih
b : ml HCl hasil titrasi tahap kedua pada
stoples blanko
N : molaritas HCl
t : waktu inkubasi
A
|
 |
 |
 |
Gambar
1 Larutan KOH ditambahkan indikator phenolftalein sampai berwarna merah jambu
(A); Larutan A kemudian dititrasi dengan HCl sampai warna merah jambu hilang
(B): Larutan B kemudian ditambahkan indikator metil oranye dan dititrasi dengan
HCl sampai larutan berwarna oranye (C).
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Uji viabilitas benih mentimun melalui uji
tetrazolium
Hasil
sidik ragam pengaruh metode uji daya berkecambah 3 lot benih mentimun
menggunakan pleated paper dan uji
tetrazolium terdapat pada tabel 2. Metode uji daya berkecambah pleated paper berpengaruh nyata terhadap
persentase daya berkecambah lot benih. Koefisien keragaman antar ulangan maupun
dalam ulangan pada metode pleated paper
dan uji tetrazolium tergolong kecil sehingga data diasumsikan reliable.
Tabel 2 Sidik ragam
pengaruh metode uji terhadap daya berkecambah 3 lot benih mentimun
Metode Uji
|
F hitung
|
P Value
|
Koefisien
Keragaman
|
Plated Paper
|
11.73*
|
0.0031
|
3.55
|
Tetrazolium Test
|
1.82tn
|
0.24
|
4.79
|
Setiap lot benih
mentimun yang diuji memiliki persentase daya berkecambah yang berbeda. Hasil
pengukuran daya berkecambah 3 lot benih mentimun menggunakan metode pleated paper dan uji tetrazlium dapat
dilihat pada tabel 3.
Tabel
3 Daya berkecambah 3 lot benih mentimun menggunakan metode pleated paper dan uji tetrazolium
Lot Benih
|
Daya
berkecambah (%) pada metode pleated
paper
|
Daya
berkecambah (%) pada uji tetrazolium
|
A
|
65.74 c
|
74.52 a
|
B
|
90.33 ab
|
70.87 a
|
C
|
94.65 a
|
74.46 a
|
Keterangan: Angka yang
diikuti huruf sama pada kolom yang sama tidak berbeda nyata pada uji Beda Nyata
Terkecil (BNt) dengan taraf α=0.05.
Persentase daya
berkecambah lot C paling tinggi namun tidak berbeda secara nyata dengan lot B
menggunakan metode pleated paper
yakni berkisar 90-94%. Lot C merupakan lot benih dengan tanggal kadaluarsa
April 2017 (masih 1 tahun lagi). Sedangkan lot A memiliki persentase daya
berkecambah terendah karena lot A adalah lot yang sudah kadaluarsa lewat 2
tahun 3 bulan.
Pada pengujian
tetrazolium, ketiga lot memiliki kisaran viabilitas (70-74%) tidak berbeda
nyata antar lot. Hal tersebut mungkin disebabkan oleh metode perendaman benih
dalam tetrazolium kurang tepat. Seharusnya lapisan testa dan kulit ari yang
menyelimuti benih dibuang terlebih dahulu saat benih akan sirendam dalam
larutan tetrazolium. Benih dibelah menjadi 2 bagian setelah direndam.
Kenyataannya sebagian lapisan kulit ari benih belum terkelupas sempurna sehingga
imbibisi larutan 2,3,5 triphenil tetrazolium klorida pada benih mentimun
terjadi sempurna.
 A |
 |
 |
 |
|||||||
 E |
 |
|
 |
|||||||
Gambar
2 Hasil pengujian daya berkecambah timun menggunakan metode pleated paper (A); Hasil pengujian
viabilitas benih menggunakan uji tetrazolium (A-H): Benih dapat tumbuh (germinable) / benih sepenuhnya berwarna
merah (B); Benih dapat tumbuh (germinable)
/ hanya bagian kecil endosperm tidak berwarna (C dan D); Benih tidak dapat
tumbuh (nongerminable): embrio dan
>50% endosperm tidak berwarna merah (E), >50% endosperm tidak berwarna
merah (F), warna merah tidak merata pada sebagian besar embrio dan endosperm (G)
dan embrio dan endosperma tidak berwarna merah (H).
Uji
korelasi dilakukan pada parameter daya berkecambah hasil uji tetrazolium dan pleated paper (tabel 4).
Tabel
4 Korelasi daya berkecambah 3 lot benih mentimun menggunakan metode pleated paper dan uji tetrazolium
Parameter
|
A
|
B
|
C
|
Daya Berkecambah (%) pada uji pleated paper
|
|||
Daya berkecambah (%) pada uji tetrazolium
|
-0.2819
|
-0.4022
|
-0.87028
|
Nilai korelasi -0.2819 pada benih mentimun lot A menunjukkan bahwa
viabilitas benih yang diuji tetrazolium berhubungan lemah yang bersifat negatif
dengan daya berkecambah yang diuji menggunakan pleated paper, kenaikan viabilitas yang diuji dengan uji
tetrazolium diikuti oleh penurunan nilai DB. Seperti halnya lot A, lot B dan
lot C juga memiliki hubungan lemah yang bersifat negatif antara nilai
viabilitas uji tetrazolium dan nilai DB sebenarnya.
B.
Uji
viabilitas mentimun melalui pengukuran laju respirasi
Hasil
sidik ragam pengaruh pengukuran laju respirasi dan BKKN pada 3 lot benih
mentimun terdapat pada tabel 5. Berat Kering Kecambah Normal (BKKN) berpengaruh
nyata terhadap persentase daya berkecambah lot benih. Koefisien keragaman antar
ulangan maupun dalam ulangan pada peubah laju respirasi dan BKKN sangat kecil
sehingga data yang didapatkan tergolong reliable.
Tabel 5 Sidik ragam
pengaruh pengukuran laju respirasi dan BKKN pada 3 lot benih mentimun
Sumber
Keragaman
|
F hitung
|
P Value
|
Variance
|
Berat Kering Kecambah Normal (g)
|
13.36*
|
0.002
|
0.00079
|
Laju respirasi (mgCO2/jam/benih)
|
3.14tn
|
0.09
|
0.017035
|
Aktivitas
metabolisme yang dapat digunakan dalam deteksi viabilitas benih misalnya laju
respirasi. Beberapa faktor yang mempengaruhi hasil pengukuran laju respirasi
adalah suhu, volume dan konsentrasi, luas permukaan, lama inkubasi, viabilitas
benih dan kontaminasi mikroorganisme. Hasil pengukuran
laju respirasi dan BKKN pada 3 lot benih mentimun ditunjukkan pada tabel 6.
Tabel
6 Laju respirasi dan BKKN pada 3 lot benih mentimun
Lot Benih
|
Laju respirasi
(mg CO2/jam/benih)
|
Berat Kering
Kecambah Normal (g)
|
A
|
0.9416 b
|
0.1167 c
|
B
|
1.0424 a
|
0.1515 b
|
C
|
1.1281 a
|
0.1757 a
|
Keterangan: Angka yang
diikuti huruf sama pada kolom yang sama tidak berbeda nyata pada uji Beda Nyata
Terkecil (BNt) dengan taraf α=0.05.
Berdasarkan
hasil uji lanjut beda nyata terkecil (BNt) pada taraf 95% menunjukkan bahwa
laju respirasi lot C tertinggi namun tidak berbeda secara nyata dengan lot B.
Laju respirasi yang tinggi pada lot C juga diiringi oleh nilai BKKN tertinggi.
Semakin besar laju respirasi maka aktifitas metabolisme dalam hal ini respirasi
juga tinggi. Organ-organ yang aktif bermetabolisme merombak cadangan makanan
yang ada untuk tumbuh dan berkembang menjadi kecambah normal sehingga nilai
BKKN juga semakin tinggi.
Aktifitas
respirasi ini juga didukung oleh data uji tetrazolium yang semakin tinggi pada
lot C yang menunjukkan bahwa aktivitas enzim dehidrogenase yang semakin tinggi.
Bila indikator diimbibisi oleh benih ke dalam sel-sel benih yang hidup akan
terjadi proses reduksi dengan menerima hydrogen dari enzim dehidrogenase
sehingga terbentuk zat trifenil formazan yang stabil dan berwarna merah (Ilyas
dan Widajati 2015).
Tabel
7 Korelasi laju respirasi dan BKKN pada 3 lot benih mentimun
A
|
B
|
C
|
|
Respirasi (mgCO2)
|
|||
Berat Kering Kecambah Normal (g)
|
0.9936
|
-0.7769
|
0.5338
|
Nilai korelasi 0.9936 lot A menunjukkan bahwa berat kering kecambah normal
sangat berhubungan erat dengan respirasi, kenaikan BKKN diikuti pula oleh
kenaikan respirasi. Nilai korelasi -0.7769 pada lot B menunjukkan bahwa berat
kering kecambah normal berhubungan erat
yang besifat negatif dengan respirasi, kenaikan BKKN akan diikuti pula oleh
penurunan respirasi. Nilai korelasi 0,5338 lot C menunjukkan BKKN memiliki
hubungan yang lemah dengan respirasi.
KESIMPULAN
Benih mentimun lot
C (lot kadaluarsa April 2017) memiliki nilai daya berkecambah tertinggi pada
metode pleated paper. Aktifitas enzim
dehidrogenase yang tinggi pada lot benih C ditunjukkan oleh nilai viabilitas (germinable) pada uji tetrazolium paling
tinggi namun tidak berbeda nyata dengan lot A dan lot B.
Laju respirasi
yang tinggi pada lot C juga diiringi oleh nilai BKKN tertinggi. Semakin besar
laju respirasi maka aktifitas metabolisme dalam hal ini respirasi juga tinggi.
Organ-organ yang aktif bermetabolisme merombak cadangan makanan yang ada untuk
tumbuh dan berkembang menjadi kecambah normal sehingga nilai BKKN juga semakin
tinggi.
DAFTAR
PUSTAKA
[ISTA] Internasional Seed Testing Association. 2014.
International Rules for Seed Testing: Edition 2014. The International Seed
Testing Association. Switzerland (CH): ISTA.
Copeland
LO, McDonald MB. 2001. Principles of Seed Science and Technology 4th Edition.
London (UK): Kluwer Academic Publishers.
Ilyas
S. 2012. Ilmu dan Teknologi Benih.
Bogor (ID) : PT Penerbit IPB Press.
Ilyas
S, Widajati E 2015. Teknik dan Prosedur
Pengujian Mutu Benih Tanaman Pangan. Bogor (ID): IPB Press.
No comments:
Post a Comment