DETEKSI VIABILITAS BENIH MENTIMUN MELALUI UJI TETRAZOLIUM DAN PENGUKURAN LAJU RESPIRASI
Latar Belakang
Benih disebut viabel atau nonviabel bergantung pada kemampuannya berkecambah dan menghasilkan kecambah normal. Menurut seed physiologist, perkecambahan didefinisikan sebagai munculnya radikula melalui kulit benih (testa). Bagi seed analyst, perkecambahan adalah muncul dan berkembangnya struktur esensial embrio yang menunjukkan kemampuan menghasilkan tanaman normal pada kondisi favorable (optimum) (Ilyas 2012).
Pengujian daya berkecambah merupakan salah satu metode pengujian viabilitas benih dengan indikasi langsung, artinya pada akhir pengujian penguji / analis mendapatkan hasil pengujian berupa kecambah-kecambah yang harus dinilai/diamati. Tujuan dari pengujian daya berkecambah adalah untuk menentukan potensi perkecambahan maksimum dari suatu lot benih yang dapat digunakan untuk membandingkan mutu benih dari lot yang berbeda dan untuk menduga mutu benih sebagai bahan tanam (Ilyas dan Widajati 2015).
Pengujian vigor bertujuan untuk mendapatkan informasi tentang nilai daya tumbuh (planting value) dalam kondisi lingkungan kisaran luas dan/atau potensi penyimpanan dari lot benih. Pengujian ini memberikan informasi tambahan dalam pengujian daya berkecambah untuk membantu dalam pembedaan antar lot benih dengan daya berkecambah yang sudah memenuhi persyaratan (Acceptable germination). Lot benih yang dikategorikan bervigor tinggi adalah benih yang mampu untuk berkembang dengan baik walaupun dibawah kondisi lingkungan yang tidak optimal untuk pertumbuhan spesies benih tersebut.
Pengujian vigor benih dapat dilakukan secara langsung atau tidak langsung. Metode langsung dilakukan dengan menguji benih pada lingkungan yang tidak sesuai (environtment stresses) atau kondisi lain yang dapat diciptakan di laboratorium dan dilakukan pencatatan persentase dan/atau kecepatan munculnya kecambah. Pengujian vigor benih secara langsung diantaranya corn cold test, hoppe test, brick grit test, osmotic test, AAT atau RAM.
Pengukuran tidak langsung dapat dilakukan dengan 1) pendekatan fisiologi : Indeks vigor, kecepatan perkecambahan, keserempakan tumbuh, pengukuran bobot kecambah, pengukuran pertumbuhan linier struktur embrio 2) pendekatan fisik : warna benih, bobot benih (gravitasi spesifik), daya hantar listrik (DHL), X-Ray test 3) pendekatan biokimiawi : Uji TTZ, kandungan ATP, aktivitas respirasi, kebocoran membran sel (gula, asam amino, asam lemak).
Uji tetrazolium merupakan uji biokimiawi yang biasa digunakan untuk menduga viabilitas benih secara cepat: jika benih yang baru dipanen akan segera ditanam, benih yang memiliki dormansi lama, benih yang perkecambahannya lambat pada saat ditanam, atau jika dibutuhkan data viabilitas potensial dengan segera. Benih viabel adalah benih yang menunjukkan pewarnaan pada jaringan –jaringan yang nantinya akan berkembang menjadi kecambah normal. Benih yang viabel harus ditunjukkan oleh aktivitas biokimiawi benih untuk menghasilkan kecambah normal. Uji tetrazolium menggunakan zat indikator 2,3,5-triphenyl tetrazolium klorida untuk mengindikasikan adanya sel-sel yang hidup. Bila imdikator diimbibisi oleh benih ke dalam sel-sel benih yang hidup akan terjadi proses reduksi dengan menerima hidrogen dari enzim dehidrognase sehingga terbentuk zat trifenil formazan yang stabil dan berwarna merah. Proses ini akan membedakan jaringan hidup yang membentuk warna merah dan jaringan mati yang tidak berwarna (ISTA 2014).
Aktivitas metabolisme yang dapat digunakan dalam deteksi viabilitas benih misalnya laju respirasi. Beberapa faktor yang mempengaruhi hasil pengukuran laju respirasi adalah suhu, volume dan konsentrasi, luas permukaan, lama inkubasi, viabilitas benih dan kontaminasi mikroorganisme.
Karakteristik uji vigor benih hasil pengujiannya dapat diulang, mewakili dan berhubungan dengan pertumbuhan di lapang di bawah kondisi tertentu, cepat, objektif, cukup mudah untuk dilakukan oleh orang yang kurang terlatih dan praktis secara ekonomi (murah) (Copeland dan Mcdonald 2001).
Tujuan
Praktikum ini bertujuan untuk menguji viabilitas benih mentimun melalui uji tetrazolium dan pengukuran laju respirasi benih mentimun dengan metode titrasi.
Metode
Tempat dan Waktu
Praktikum ini dilaksanakan pada tanggal 22 Maret- 3 Mei 2016. Pengujian viabilitas benih mentimun dilaksanakan di Laboratorium Penyimpanan dan Pengujian Mutu Benih; pengujian tetrazolium benih mentimun dilaksanakan di Laboratorium Molekuler Tanaman; pengujian respirasi benih mentimun dilaksanakan di Laboratorium Biologi dan Biofisik Benih, Departemen Agronomi dan Hortikultura, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor.
Bahan dan Alat
Bahan dan alat yang digunakan dalam pengujian daya berkecambah benih mentimun adalah 3 lot benih mentimun, kertas buram, label, alat pengepres kertas, dan boks mika. Bahan dan alat yang digunakan pada uji tetrazolim benih mentimun adalah 3 lot benih mentimun, larutan garam tetrazolium 0.7%, aquades,glass jar, pinset, mikroskop stereo, dan kamera. Bahan dan alat yang digunakan pada uji respirasi benih mentimun adalah 3 lot benih mentimun, KOH 0.2 M, HCl 0.4 M, indikator phenolftalein, indikator metal orange, aquades, pipet, erlenmeyer, stoples, glass jar, selotip, dan kertas buram.
Tabel 1 Identitas lot benih yang digunakan dalam praktikum
Lot
|
Varietas
|
Tanggal kadaluarsa
|
A
|
Penus
|
Februari 2014
|
B
|
Vanesa
|
Juli 2016
|
C
|
Vanesa
|
April 2017
|
Rancangan Percobaan dan Analisis Data
Percobaan dilakukan dengan menggunakan rancangan acak lengkap, dimana lot benih mentimun (lot A, lot B, dan lot C) sebagai faktor perlakuan. Masing-masing perlakuan dibuat dalam 4 ulangan. Masing-masing lot diuji mutunya menggunakan 3 metode uji mutu yaitu uji daya berkecambah, uji tetrazolium, dan uji respirasi benih.
Model linear yang digunakan dalam percobaan adalah:
Yij=µ+Ti+εij
Dimana : i=1,2,3 dan j=1,2,3,4
Yij = nilai pengamatan pengaruh perlakuan lot benih ke-i, dan ulangan ke-j
µ =nilai tengah umum hasil percobaan
Ti =pengaruh lot mentimun ke-i
εij = pengaruh acak percobaan lot benih ke-i, ulangan ke-j
Data yang diperoleh dianalisis menggunakan uji F, apabila hasil menunjukkan pengaruh nyata, maka dilakukan uji lanjut menggunakan uji Beda Nyata Terkecil (BNt) dengan taraf α=5%.
Metode Percobaan
a. Uji daya berkecambah benih mentimun dengan metode kertas dilipat / pleated paper
Kertas buram yang telah dilembabkan sebanyak 3 lembar dilipat menjadi 4 seperti kipas. Benih diletakkan diantara lipatan kertas tersebut secara merata dengan jarak tanam teratur. Jumlah benih yang digunakan tiap satu pleated paper sebanyak 25 butir. Kelembaban kertas dijaga dengan menyemprotkan air secara berkala dan kertas diletakkan dalam boks mika yang ditutup rapat. Pengamatan daya berkecambah benih mentimun dilakukan pada 3 HST (hitungan I) dan 5 HST (hitungan II) (modifikasi dari ISTA 2014).
Daya berkecambah merupakan persentase benih yang tumbuh menjadi kecambah normal dibagi dengan jumlah benih yang dikecambahkan. Perhitungan daya berkecambah dihitung dengan rumus sebagai berikut:
|
|
∑ KN hitungan I + ∑ KN hitungan II
|
|
% DB =
Keterangan:
DB : daya berkecambah (%)
KN I : kecambah normal pada hitungan pertama
KN II : kecambah normal pada hitungan kedua
b. Uji vigor benih mentimun melalui uji tetrazolium
Uji tetrazolium diawali dengan melembabkan setiap lot benih masing-masing 75 butir yang diulang sebanyak 4 ulangan. Benih mentium direndam dalam air selama 18 jam pada ruangan dengan suhu 20°C. Pengupasan testa benih dilakukan agar larutan tetrazolium mudah meresap ke dalam jaringan benih. Larutan tetrazolium 0.7% diperoleh dengan cara melarutkan 0.7 gram garam tetrazolium (2,3,5 triphenil tetrazolium chlorida) dilarutkan kedalam 100 ml aquades. Selanjutnya benih direndam dalam larutan tetrazolium klorida 0.7% sampai benih terendam seluruhnya pada suhu 40°C selama 4 jam. Setelah inkubasi selesai, larutan tetrazolium dituang dengan menggunakan saringan teh, benih dicuci dengan air mengalir sampai bersih (bebas dari larutan tetrazolium). Benih satu per satu diamati menggunakan mikroskop stereo dan diklasifikasikan sesuai dengan pola pewarnaan. Persentase benih viabel dan non viabel dihitung.
c. Uji vigor benih mentimun melalui uji respirasi benih
Uji respirasi benih mentimun dilakukan dengan langkah-langkah sebagai berikut:
- Sebanyak 3 lot benih metimun @25 butir ditanam dalam stoples yang sudah dialasi dengan 3 lembar kertas buram lembab.
- Glass jar yang berisi 30 ml larurtan KOH 0.2 N dimasukkan di posisi tengah stoples, kemudian stoples ditutup rapat dan direkatkan menggunakan lakban.
- Untuk blanko, dengan metode yang sama dengan diatas tapi tidak ditanami benih.
- Inkubasi dilakukan selama 7 hari, kemudian stoples dibuka dan larutan KOH dituang ke dalam erlenmeyar 50 ml.
- Larutan KOH di dalam erlenmeyer ditambahkan 1 tetes indikator phenolftalein dan dititrasi dengan HCl 0.4 M sampai warna merah jambu hilang.
- Selanjutnya pada erlenmeyer ditambahkan 1 tetes indikator metil orange dan dititrasi dengan HCl 0.4 M sampai terbentuk warna merah orange.
Reaksi pengikatan CO2 oleh KOH
2 KOH + CO2 K2CO3 + H2O
Titrasi tahap I
KOH + HCl KCl + H2O
Titrasi tahap II
K2CO3 +2 HCl 2 KCl + H2O + CO2
- Perhitungan aktivitas respirasi dengan menghitung CO2 yang diproduksi dengan rumus :
mg CO2 = (a-b) x N x 44
t
a : ml HCl hasil titrasi tahap kedua pada stoples berisi benih
b : ml HCl hasil titrasi tahap kedua pada stoples blanko
N : molaritas HCl
t : waktu inkubasi
Gambar 1 Larutan KOH ditambahkan indikator phenolftalein sampai berwarna merah jambu (A); Larutan A kemudian dititrasi dengan HCl sampai warna merah jambu hilang (B): Larutan B kemudian ditambahkan indikator metil oranye dan dititrasi dengan HCl sampai larutan berwarna oranye (C).
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Uji viabilitas benih mentimun melalui uji tetrazolium
Hasil sidik ragam pengaruh metode uji daya berkecambah 3 lot benih mentimun menggunakan pleated paper dan uji tetrazolium terdapat pada tabel 2. Metode uji daya berkecambah pleated paper berpengaruh nyata terhadap persentase daya berkecambah lot benih. Koefisien keragaman antar ulangan maupun dalam ulangan pada metode pleated paper dan uji tetrazolium tergolong kecil sehingga data diasumsikan reliable.
Tabel 2 Sidik ragam pengaruh metode uji terhadap daya berkecambah 3 lot benih mentimun
Metode Uji
|
F hitung
|
P Value
|
Koefisien Keragaman
|
Plated Paper
|
11.73*
|
0.0031
|
3.55
|
Tetrazolium Test
|
1.82tn
|
0.24
|
4.79
|
Setiap lot benih mentimun yang diuji memiliki persentase daya berkecambah yang berbeda. Hasil pengukuran daya berkecambah 3 lot benih mentimun menggunakan metode pleated paper dan uji tetrazlium dapat dilihat pada tabel 3.
Tabel 3 Daya berkecambah 3 lot benih mentimun menggunakan metode pleated paper dan uji tetrazolium
Lot Benih
|
Daya berkecambah (%) pada metode pleated paper
|
Daya berkecambah (%) pada uji tetrazolium
|
A
|
65.74 c
|
74.52 a
|
B
|
90.33 ab
|
70.87 a
|
C
|
94.65 a
|
74.46 a
|
Keterangan: Angka yang diikuti huruf sama pada kolom yang sama tidak berbeda nyata pada uji Beda Nyata Terkecil (BNt) dengan taraf α=0.05.
Persentase daya berkecambah lot C paling tinggi namun tidak berbeda secara nyata dengan lot B menggunakan metode pleated paper yakni berkisar 90-94%. Lot C merupakan lot benih dengan tanggal kadaluarsa April 2017 (masih 1 tahun lagi). Sedangkan lot A memiliki persentase daya berkecambah terendah karena lot A adalah lot yang sudah kadaluarsa lewat 2 tahun 3 bulan.
Pada pengujian tetrazolium, ketiga lot memiliki kisaran viabilitas (70-74%) tidak berbeda nyata antar lot. Hal tersebut mungkin disebabkan oleh metode perendaman benih dalam tetrazolium kurang tepat. Seharusnya lapisan testa dan kulit ari yang menyelimuti benih dibuang terlebih dahulu saat benih akan sirendam dalam larutan tetrazolium. Benih dibelah menjadi 2 bagian setelah direndam. Kenyataannya sebagian lapisan kulit ari benih belum terkelupas sempurna sehingga imbibisi larutan 2,3,5 triphenil tetrazolium klorida pada benih mentimun terjadi sempurna.
A
|
|
|
|
E
|
|
|
|
| | | | |
Gambar 2 Hasil pengujian daya berkecambah timun menggunakan metode pleated paper (A); Hasil pengujian viabilitas benih menggunakan uji tetrazolium (A-H): Benih dapat tumbuh (germinable) / benih sepenuhnya berwarna merah (B); Benih dapat tumbuh (germinable) / hanya bagian kecil endosperm tidak berwarna (C dan D); Benih tidak dapat tumbuh (nongerminable): embrio dan >50% endosperm tidak berwarna merah (E), >50% endosperm tidak berwarna merah (F), warna merah tidak merata pada sebagian besar embrio dan endosperm (G) dan embrio dan endosperma tidak berwarna merah (H).
Uji korelasi dilakukan pada parameter daya berkecambah hasil uji tetrazolium dan pleated paper (tabel 4).
Tabel 4 Korelasi daya berkecambah 3 lot benih mentimun menggunakan metode pleated paper dan uji tetrazolium
Parameter
|
A
|
B
|
C
|
Daya Berkecambah (%) pada uji pleated paper
|
Daya berkecambah (%) pada uji tetrazolium
|
-0.2819
|
-0.4022
|
-0.87028
|
Nilai korelasi -0.2819 pada benih mentimun lot A menunjukkan bahwa viabilitas benih yang diuji tetrazolium berhubungan lemah yang bersifat negatif dengan daya berkecambah yang diuji menggunakan pleated paper, kenaikan viabilitas yang diuji dengan uji tetrazolium diikuti oleh penurunan nilai DB. Seperti halnya lot A, lot B dan lot C juga memiliki hubungan lemah yang bersifat negatif antara nilai viabilitas uji tetrazolium dan nilai DB sebenarnya.
B. Uji viabilitas mentimun melalui pengukuran laju respirasi
Hasil sidik ragam pengaruh pengukuran laju respirasi dan BKKN pada 3 lot benih mentimun terdapat pada tabel 5. Berat Kering Kecambah Normal (BKKN) berpengaruh nyata terhadap persentase daya berkecambah lot benih. Koefisien keragaman antar ulangan maupun dalam ulangan pada peubah laju respirasi dan BKKN sangat kecil sehingga data yang didapatkan tergolong reliable.
Tabel 5 Sidik ragam pengaruh pengukuran laju respirasi dan BKKN pada 3 lot benih mentimun
Sumber Keragaman
|
F hitung
|
P Value
|
Variance
|
Berat Kering Kecambah Normal (g)
|
13.36*
|
0.002
|
0.00079
|
Laju respirasi (mgCO2/jam/benih)
|
3.14tn
|
0.09
|
0.017035
|
Aktivitas metabolisme yang dapat digunakan dalam deteksi viabilitas benih misalnya laju respirasi. Beberapa faktor yang mempengaruhi hasil pengukuran laju respirasi adalah suhu, volume dan konsentrasi, luas permukaan, lama inkubasi, viabilitas benih dan kontaminasi mikroorganisme. Hasil pengukuran laju respirasi dan BKKN pada 3 lot benih mentimun ditunjukkan pada tabel 6.
Tabel 6 Laju respirasi dan BKKN pada 3 lot benih mentimun
Lot Benih
|
Laju respirasi
(mg CO2/jam/benih)
|
Berat Kering Kecambah Normal (g)
|
A
|
0.9416 b
|
0.1167 c
|
B
|
1.0424 a
|
0.1515 b
|
C
|
1.1281 a
|
0.1757 a
|
Keterangan: Angka yang diikuti huruf sama pada kolom yang sama tidak berbeda nyata pada uji Beda Nyata Terkecil (BNt) dengan taraf α=0.05.
Berdasarkan hasil uji lanjut beda nyata terkecil (BNt) pada taraf 95% menunjukkan bahwa laju respirasi lot C tertinggi namun tidak berbeda secara nyata dengan lot B. Laju respirasi yang tinggi pada lot C juga diiringi oleh nilai BKKN tertinggi. Semakin besar laju respirasi maka aktifitas metabolisme dalam hal ini respirasi juga tinggi. Organ-organ yang aktif bermetabolisme merombak cadangan makanan yang ada untuk tumbuh dan berkembang menjadi kecambah normal sehingga nilai BKKN juga semakin tinggi.
Aktifitas respirasi ini juga didukung oleh data uji tetrazolium yang semakin tinggi pada lot C yang menunjukkan bahwa aktivitas enzim dehidrogenase yang semakin tinggi. Bila indikator diimbibisi oleh benih ke dalam sel-sel benih yang hidup akan terjadi proses reduksi dengan menerima hydrogen dari enzim dehidrogenase sehingga terbentuk zat trifenil formazan yang stabil dan berwarna merah (Ilyas dan Widajati 2015).
Tabel 7 Korelasi laju respirasi dan BKKN pada 3 lot benih mentimun
|
A
|
B
|
C
|
Respirasi (mgCO2)
|
Berat Kering Kecambah Normal (g)
|
0.9936
|
-0.7769
|
0.5338
|
Nilai korelasi 0.9936 lot A menunjukkan bahwa berat kering kecambah normal sangat berhubungan erat dengan respirasi, kenaikan BKKN diikuti pula oleh kenaikan respirasi. Nilai korelasi -0.7769 pada lot B menunjukkan bahwa berat kering kecambah normal berhubungan erat yang besifat negatif dengan respirasi, kenaikan BKKN akan diikuti pula oleh penurunan respirasi. Nilai korelasi 0,5338 lot C menunjukkan BKKN memiliki hubungan yang lemah dengan respirasi.
KESIMPULAN
Benih mentimun lot C (lot kadaluarsa April 2017) memiliki nilai daya berkecambah tertinggi pada metode pleated paper. Aktifitas enzim dehidrogenase yang tinggi pada lot benih C ditunjukkan oleh nilai viabilitas (germinable) pada uji tetrazolium paling tinggi namun tidak berbeda nyata dengan lot A dan lot B.
Laju respirasi yang tinggi pada lot C juga diiringi oleh nilai BKKN tertinggi. Semakin besar laju respirasi maka aktifitas metabolisme dalam hal ini respirasi juga tinggi. Organ-organ yang aktif bermetabolisme merombak cadangan makanan yang ada untuk tumbuh dan berkembang menjadi kecambah normal sehingga nilai BKKN juga semakin tinggi.
DAFTAR PUSTAKA
[ISTA] Internasional Seed Testing Association. 2014. International Rules for Seed Testing: Edition 2014. The International Seed Testing Association. Switzerland (CH): ISTA.
Copeland LO, McDonald MB. 2001. Principles of Seed Science and Technology 4th Edition. London (UK): Kluwer Academic Publishers.
Ilyas S. 2012. Ilmu dan Teknologi Benih. Bogor (ID) : PT Penerbit IPB Press.
Ilyas S, Widajati E 2015. Teknik dan Prosedur Pengujian Mutu Benih Tanaman Pangan. Bogor (ID): IPB Press.